Жизнь замечательных устройств - читать онлайн книгу. Автор: Аркадий Курамшин cтр.№ 73

Как уже говорилось выше, ожидалось, что быстрое охлаждение избавит электронную микроскопию от целого ряда ограничений и позволит применять её к биомолекулам. Предполагалось, что проблемы, связанные с образованием кристалликов льда, удастся преодолеть с помощью быстрой заморозки, благодаря которой вода будет превращаться не в кристаллическую, а стеклообразную твердую фазу. Однако до 1980-х годов сама принципиальная возможность получения твердой стеклообразной воды была дискуссионной — предполагалось, что скорость охлаждения, необходимая для превращения воды в «правильное» агрегатное состояние, никогда не будет достигнута.

В 1980 году дискуссии на тему стеклообразного состояния воды были закрыты — исследователям удалось заморозить микрометровые капли воды, переведя её в стеклообразное состояние (Nature 288, 1980, 569–571; DOI: 10.1038/288569a0). Годом позже Жак Дюбоше и Алесдер МакДауэлл продемонстрировали метод, позволяющий получить тонкую плёнку твердой некристаллической воды для заморозки образцов и их последующего изучения с помощью электронной микроскопии (J. Microsc., 1981, 124, 3–4; DOI: 10.1111/j.1365–2818.1981.tb02483.x).

Предложенный метод заключался в следующем: воду распыляли на углеродную плёнку, поверх которой была размещена сетка, которую быстро погружали в жидкий этан или пропан с температурой около -190 °C, которая поддерживалась за счет охлаждения жидким азотом. Как было показано, тонкий слой стеклообразной твёрдой воды демонстрировал однородное поглощение электронов в процессе изучения криоэлектронной микроскопии. От аморфного состояния воды к кристаллическому можно было перейти, нагревая образец до -140 °C. В последующие годы Дюбоше усовершенствовал метод заморозки и приготовления образца для электронной микроскопии, а также описал результаты подробных исследований чистой воды, водных растворов и суспензий бактериофагов и молекул ДНК при криогенных температурах (J. Microsc., 1982, 128, 219–237; DOI: 10.1111/j.1365–2818.1982.tb04625.x).

Полностью потенциал метода Дюбоше был оценен в 1984 году, когда его группа опубликовала электронные микрографии суспензий вирусов (Nature, 1984, 308, 32–36; DOI: 10.1038/308032a0). Использованная для получения этих микрографий методика позволяла получать слои воды достаточно тонкие для быстрого превращения воды в стеклообразное состояние, но при этом достаточно толстые для того, чтобы в этом слое мог поместиться монослой биологически активных молекул или молекулярных комплексов в их естественной конформации.

Достижения электронной (в том числе и криоэлектронной) микроскопии последнего десятилетия связаны с улучшением конструкционных элементов электронных микроскопов — сейчас в них применяются новые детекторы, позволяющие уверенно детектировать меньшее количество электронов, новые электронные пушки (источники электронов) и новые камеры, позволяющие практически исключить влияющие на точность микроскопического исследования колебания температуры. Вся эта модернизация, произошедшая уже в XXI веке, позволила и значительно повысить соотношение сигнал-шум, что дает возможность получать более детальные результаты анализа, и увеличить скорость анализа образца, в результате чего отдельные микрографии объектов можно склеить в «фильм» из их жизни. Всё это, как и предполагал Хендерсон в прошлом веке, действительно превратило электронную микроскопию в распространённый и доступный метод исследования, применяющийся повсеместно — от материаловедения до исследования биологических систем. Можно отметить, что настоящий расцвет криоэлектронной микроскопии как метода для изучения биологических систем начинается с 2012-13 годов и связан с появлением прямых электронных детекторов, применение которых, например, позволило в деталях изучить ионный канал клеточной мембраны TRPV1 (Nature 504, 2013, 107–112: DOI: 10.1038/nature12822). И, наконец, в этом, 2017 году, спустя почти шесть десятилетий после кристаллографического определения строения миоглобина и гемоглобина Джоном Кендрю и Максом Перутцом (именно благодаря этой работе в 1962 году они стали Нобелевскими лауреатами) и спустя четыре года после опубликования первых работ, ставших основой для разработки метода криоэлектронной микроскопии высокого разрешения, электронный микроскоп позволил определить структуру гемоглобина — криоэлектронная микроскопия позволила исследовать одну молекулу гемоглобина, к тому же находящуюся в растворе (Nature Comm., 2017, 8, 16099; doi:10.1038/ncomms16099).

Чем плохи другие методы, например — рентгеноструктурный анализ и ядерный магнитный резонанс?

Известные до криоэлектронной микроскопии и применяющиеся и сейчас методы изучения вещества, в том числе и живого вещества, нельзя назвать плохими, криоэлектронная микроскопия не отменяет, а дополняет их. Более того, как знает любой химик — чем большим количеством методов установлена структура того или иного вещества или системы веществ, тем более надёжными являются результаты исследования. Многие из классических методов позволяют получить исчерпывающую информацию о белках, нуклеиновых кислотах, а в ряде случаев — о молекулярных комплексах, образуемых биологически активными молекулами. Проблема заключается не столько в самих классических методах, сколько в подготовке образцов для исследования. Подготовить пробу для её изучения с помощью криоэлектронного микроскопа несколько проще — можно сказать, что в этом случае способ подготовки пробы заключается в приготовлении водного раствора чистого образца биологически активного вещества

Так, считающийся в настоящий момент главным доказательным методом в химии рентгеноструктурный анализ (РСА) также позволяет получать изображения биологически активных молекул с очень высоким разрешением и значительной степенью детализации — зачастую его сравнивают со способом, позволяющим «сфотографировать» молекулу, определив положение атомов в её составе с точностью до одного ангстрема. Более того, за изучение белков и нуклеиновых кислот методом рентгеноструктурного анализа была присуждена не одна Нобелевская премия. Наиболее известна Нобелевская Премия по физиологии и медицине 1962 года, которую получили Джеймс Уотсон, Френсис Крик и Морис Уилкинсон, которые установили двуспиральное строение ДНК именно с помощью рентгеноструктурного анализа. Любопытно, что в этот же 1962 год лауреатами «химической» Нобелевской премии стали Макс Перуц и Джон Кендрю, использовавшие рентгеноструктурный анализ для изучения строения гемоглобина и других белков. Тем не менее, для того чтобы изучить белок или другую биологически активную молекулу с помощью РСА, необходимо получить кристаллический образец предмета исследования. Бывает, что между определением первичной структуры белка и подготовкой кристаллического образца для определения третичной структуры проходят годы, бывает, что белок просто не кристаллизуется. В ряде случаев в процессе кристаллизации белок принимает форму, значительно отличающуюся от той, которая характерна для него в естественном биологическом окружении. Для изучения биомолекул с помощью криоэлектронной микроскопии не нужно готовить кристаллические образцы, это позволяет и снизить время на исследование, и использовать меньшее количество изучаемого образца. То, что для криоэлектронной микроскопии биосистем нужен только раствор, содержащий образец, а свойства такого раствора (кислотность, солевой фон и т. п.) можно менять перед заморозкой, позволяет применять метод для определения строения биомолекулы в тех условиях, которые недоступны для рентгеноструктурного анализа.