Жизнь замечательных устройств - читать онлайн книгу. Автор: Аркадий Курамшин cтр.№ 71

Улучшения в методы исследования биологических объектов с помощью электронной микроскопии внёс в том числе и Аарон Клуг, получивший в 1982 году Нобелевскую премию по химии «…за разработку метода кристаллографической электронной микроскопии и прояснение структуры биологически важных комплексов нуклеиновая кислота — белок…». Он одним из первых пришел к тому, что для уточнения трехмерной структуры объекта, полученного с помощью метода негативного контрастирования, необходимо получать двумерные проекции с различных направлений, что можно организовать, изменяя угол, под которым на образец направляется поток электронов, или проводя анализ большого количества частиц, ориентированных различным образом. В 1960-х годах Клуг применил свои подходы, с помощью электронного микроскопа изучив тонкие кристаллы каталазы (Berichte der Bunsengesellschaft für physikalische Chemie, 1970, 74, 1129–1137; DOI: 10.1002/bbpc.19700741109).

В 1968 году Клуг совместно с Давидом ДеРозье сообщили о первом удачном примере вычисления трехмерной модели биологического объекта на основании информации о двумерных проекциях, полученных с помощью электронного микроскопа. Исследователи изучили хвост бактериофага T4, он был выбран в качестве объекта исследования благодаря своей спиралевидной симметрии. Для него трехмерную модель можно было построить, анализируя лишь одну двумерную проекцию, которая давала ровно такую же информацию, которую можно было получить, анализируя хвост вируса под другими углами (Nature, 1968, 217, 130–134; DOI:10.1038/217130a0).

Получение информации о трёхмерной структуре частиц, не обладающей спиралевидной симметрией, требует комбинирования данных от нескольких двумерных проекций этих частиц. В 1970 году Клуг совместно с ДеРозье и Энтони Краутером разработал подход, получивший название подхода общих линий, с помощью которого была определена трехмерная структура икосаэдрических конвертов вирусов (Proc. R. Soc. London., 1970, A 317, 319–340; DOI: 10.1098/rspa.1970.0119). В работе предполагалось, что аналогичный метод можно применить к частицам, не обладающим симметрией, но более эффективные результаты он даёт при анализе симметричных образцов.

Ещё одним шагом к применению электронной микроскопии в биохимии была разработка способов, позволяющих сохранить гидратированное состояние биомолекулы в камере электронного микроскопа, а также определить условия, в которых излучение прибора не разрушало бы анализируемый объект. Для этого Дональд Парсонс разработал конструкции камер электронного микроскопа, в которых поддерживалась влажность и комнатная температура (Science, 1974 186, 407–414; DOI: 10.1126/science.186.4162.407). Эти камеры позволили ему использовать электронную микроскопию для изучения кристаллов фермента-каталазы и найти условия, в которых облучение электронами не оказывает влияние на строение белка.

Также в 1970-е Роберту Глэйзеру удалось количественно оценить степень повреждения кристаллической каталазы и низкомолекулярных органических соединений в результате облучения потоком электронов (J. Ultrastruct. Res., 1971, 36, 466–482; DOI: 10.1016/S0022-5320(71)80118-1). Он же пришёл к выводу о том, что применение для анализа небольших доз электронов будет приводить к необходимости использования большого количества анализируемых объектов, что может увеличить соотношение сигнал-шум. Другими словами, изучение с помощью электронной микроскопии большого количества частиц приведет к тому, что та энергия излучения, которая могла бы повредить небольшое количество изучаемых объектов, будет просто равномерно распределена между большим количеством биомолекул одного и того же типа (J. Mol. Biol., 1975, 94, 425–432; DOI: 10.1016/0022-2836(75)90212-0). Охлаждение объекта исследования считалось ещё одним способом, который одновременно может понизить скорость испарения воды и защитить биологический материал от повреждения электронным пучком. В 1950-60-х годах Умберто Моран изучал возможности заморозки образцов и приготовления чрезвычайно тонких препаратов для их изучения с помощью криоэлектронной микроскопии (Annals of the New York Academy of Sciences, 1960, 85, 689–713; DOI: 10.1111/j.1749–6632.1960.tb49990.x). Однако при охлаждении вода обычно замерзает с образованием мельчайших кристалликов льда, на которых происходит дифракция электронов, в значительной степени искажающая сигналы, полученные при изучении образца, не говоря уже про то, что кристаллики льда могли изменить строение изучаемого объекта. О проблемах, связанных с образованием кристалликов льда при охлаждении клеток было известно ещё с 1940-х годов. Пытавшийся подбирать способы безопасного охлаждения Базиль Люе предлагал снизить негативное влияние холода на биологические образцы за счет ускорения процесса заморозки: быстрая заморозка способствует тому, что при этом вода затвердевает, формируя не кристаллическую, а аморфную твёрдую структуру. В 1960-е годы быстрая заморозка в первую очередь была применена для изучения белков с помощью рентгеноструктурного анализа. Помимо ударной заморозки образованию кристалликов льда препятствовало введение в образец антифризов — сахарозы или глицерина (Acta Crystallogr B, 1970, 26, 998-1004; DOI: 10.1107/S0567740870003485).

Чуть позже Глейзер и Кеннет Тейлор показали, что при быстрой заморозке электронная микроскопия позволяет изучить кристаллы каталазы, получая картинку с разрешением в 3 Å, не прибегая при этом к контрастированию. Доступная в то время технология заморозки позволяла проводить исследования при температуре выше -120 °C, при которой уже наблюдается переход от аморфного к кристаллическому льду. Тем не менее, в условиях эксперимента кристаллики льда не образовывались, причиной чего исследователи предположили взаимодействие молекул воды с поверхностью белка (Nature 271, 1978, 659–660; DOI:10.1038/271659a0). Тейлор и Глейзер также разработали методы, позволяющие хранить биологические образцы при криогенных температурах, показав, что охлаждение образца позволяет использовать зондирование с помощью электронных пучков большей интенсивности, говоря другими словами — охлаждение образца увеличивает его информационную ёмкость. На какое-то время развитие методов, эксплуатировавших электронную микроскопию в биохимии, прекратилось — до 1990-х годов существенных модификаций методов не предпринималось, казалось, что электронный микроскоп позволяет биохимикам узнать если не всё про биомолекулы, а хотя бы всё то, что позволяла существующая в то время техника.

Однако человек устроен так, что ему всегда хочется большего, и желание получить больше информации об объекте с помощью электронной микроскопии не было исключением. Начало 1990-х годов вполне можно считать вехой в развитии криоэлектронной микроскопии: в 1990 году первый из Нобелиатов по химии 2017 года — Хендерсон — с коллегами впервые продемонстрировал возможность практического применения криоэлектронной микроскопии для получения высококачественных изображений биологических объектов за счет совмещения и усреднения копий изображений, полученных для одного и того же объекта, организованного в двумерный кристалл.