Жизнь замечательных устройств - читать онлайн книгу. Автор: Аркадий Курамшин cтр.№ 72

Для своей пионерской работы Хендерсон с коллегами смогли получить качественную информацию о строении бактериородопсина, используя для его исследования сразу несколько электронных микроскопов, расположенных в различных научных центрах и оптимизируя информацию, полученную с каждого устройства (J. Mol. Biol., 1990, 213, 899–929; DOI: 10.1016/S0022-2836(05)80271-2). В ходе исследования был обнаружен ряд технических ограничений, свойственных этим микроскопам, а также обозначены проблемы, связанные с приготовлением образцов. Хендерсон сделал вывод о том, что ни один из электронных микроскопов, использованных в исследовании, не был идеален, предположив тем не менее, что ряд модификаций как принципиального устройства электронных микроскопов, так и подготовки образца для исследования в конечном итоге может превратить криоэлектронную микроскопию в быстрый и обычный метод определения строения биологических препаратов, который, в конечном итоге, может оказаться способным изучать в том числе и ассоциаты биологически активных молекул, не обладающие кристаллической и симметричной структурой. Главной проблемой изучения асимметрических частиц, располагающихся без формирования дальнего порядка, было определение положения и ориентации каждой частицы в исследуемом образце на основании генерируемого этой частицей слабого сигнала по измерению соотношения сигнал-шум, однако решение этой задачи силами компьютерной техники, доступной исследователям в 1990 году, было просто невозможно (J. Struct. Biol. 128, 3-14; DOI: 10.1006/jsbi.1999.4172). За последующее десятилетие подходы, похожие на подходы Хендерсона, были использованы другими группами для получения качественных изображений целого ряда биомолекул, среди которых были светопоглощающий комплекс хлорофилл-белок, тубулиновый димер и аквапорин.

Спустя пять лет после выхода статьи про структуру бактериородопсина, полученную с большим разрешением, Хендерсон представил детальный анализ задач, который требовалось решить для изучения с высоким разрешением не формирующих кристаллические структуры ассоциатов биологически активных молекул (Q. Rev. Biophys., 1995, 28, 171–193; DOI: 10.1017/S003358350000305X). Его выводы сводились к тому, что при применении малоинтенсивного недеструктивного облучения электронами при проведении исследований с помощью электронной микроскопии в присутствии фазового контраста будет возможно определить двумерное положение индивидуальных частиц в плоскости двумерного кристалла и их трёхмерную ориентацию в том, правда, случае, если частицы обладают достаточной молекулярной массой. Выводы Хендерсона были таковы — для биомолекул (и ассоциатов биомолекул) с молекулярной массой больше 50 килодальтон возможно получить образец, содержащий достаточное количество частиц (около 10000 частиц) для усреднения результатов их исследования с помощью электронной микроскопии и определения их строения с атомным разрешением, которое будет составлять ~3 Å. В последующие годы число частиц, необходимых для получения результатов изучения структуры с таким разрешением, постоянно корректировалось в сторону уменьшения, и к началу XXI века Глейзер пришёл к выводу, что минимальное значение молекулярной массы объекта, который можно проанализировать с разрешением в три ангстрема, составляет 20 килодальтон (J. Struct. Biol., 1999, 128, 3-14; DOI: 10.1006/jsbi.1999.4172). Хотя биомолекулы с этим значением молекулярной массы пока еще никому не удалось изучить, и самой тяжелой молекулой, строение которой помог изучить электронный микроскоп, является молекула гемоглобина с молекулярной массой 64 кДа (Nature Comm., 2017, 8, 16099; doi:10.1038/ncomms16099), разрешение, с которым удается изучить строение некоторых молекул, уже составляет величину, меньшую, чем 2 Ангстрема.

Второй из Нобелевских лауреатов 2017 года, Иоахим Франк, еще в середине 1970-х годов стал заниматься фундаментальной проблемой изучения неконтрастированных, некристаллических асимметрических частиц, случайным образом ориентированных в растворе (Ultramicroscopy, 1975, 1, 159–162; DOI: 10.1016/S0304-3991(75)80020-9). Его работа стала основой для дальнейших исследований. Основным способом решить задачу Франк полагал: «…создание условий для выравнивания тех признаков частиц, сигналы которых могут быть четко различимы на фоне значительных шумов…».

В 1977 году Франк с коллегами описал количественный подход, способный обеспечить такое выравнивание с помощью взаимной корреляции сигналов от различных частиц (Ultramicroscopy, 1977, 2, 219–227; DOI: 10.1016/S0304-3991(76)91385-1). Был сделан вывод о том, что существует возможность определить неупорядоченное расположение исследуемых частиц с помощью пучков электронов, мощность которых недостаточна для разрушения самих объектов, и далее выстроить изображение с высоким разрешением, усредняя сигналы, полученные от каждой отдельно взятой частицы. Правомерность такого вывода была продемонстрирована при изучении строения фермента глутаминсинтетазы (Ultramicroscopy, 1978, 3, 283–290; DOI: 10.1016/S0304-3991(78)80038-2).

В принципе, в идеале для некристаллических образцов, состоящих из одинаковых частиц, требовалось не так уж много информации, описывающей их положение в условной плоскости и ориентацию в трёхмерном пространстве — для решения математической задачи, определяющей эти вопросы, требуется определить всего пять параметров. Однако реальные биологические системы отличаются от идеализированной математической модели тем, что образующие их частицы редко бывают однородными по строению, да и содержат примеси. Это приводило к необходимости создания уточнённых математических моделей, тех, которые учитывают неоднородность изучаемой системы и создания алгоритмов, позволяющих сортировать результаты исследования объекта, учитывая то, какие сигналы использовать далее для построения усреднённой картины, а от каких избавляться. В 1981 году Франк с коллегами описал метод, позволяющий сортировать образы частиц на основании их ориентации и особенностей строения (Ultramicroscopy, 1981, 6, 187–194; 10.1016/0304-3991(81)90059-0). В последующих работах Франк оптимизировал и во многом уточнил методы математического анализа, позволяющие отделить зёрна полезной информации, полученной в ходе электронной микроскопии, от неизбежных плевел. В 1981 году он обобщил математические модели в компьютерной программе SPIDER (System for Processing Image Data from Electron microscopy and Related fields — Система для Обработки Данных Электронной микроскопии и Связанных областей, первая публикация: Ultramicroscopy, 1981, 6, 343–357; DOI: 10.1016/S0304-3991(81)80236-7). Этот программный пакет для обработки изображений, полученных с помощью электронной микроскопии, существует и обновляется до сих пор (https://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html), более того — эти программы свободны к распространению, что, безусловно, облегчает работу учёных во всём мире.