Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века - читать онлайн книгу. Автор: Максим Франк-Каменецкий cтр.№ 44

Наиболее убедительные доказательства были получены в опытах с кольцевыми ДНК. Это было сделано все тем же Джеймсом Уонгом из Гарварда, имя которого нами не раз упоминалось. Уонг не только однозначно доказал, что ДНК представляет собой спираль, но и с высокой точностью определил число пар, приходящихся на виток двойной спирали В-ДНК в растворе. Эта величина оказалась равной 10,5, что очень близко к величине, постулированной Уотсоном и Криком. Опыты Уонга, однако, требуют довольно сложного анализа (любознательный читатель может ознакомиться с этим анализом, раздобыв одну из предыдущих версий этой книги: М. Д. Франк-Каменецкий «Самая главная молекула», М., 1988). Здесь мы ограничимся анализом не менее убедительных, но более доступных для понимания опытов Д. Шора и Р. Болдвина из Стэнфордского университета.

Шор и Болдвин занимались изучением вопроса о том, как зависит от длины ДНК вероятность ее замыкания в кольцо. Для этого они брали молекулы, имеющие липкие концы (о таких молекулах уже шла речь в главах 5 и 8), и добавляли фермент лигазу. О вероятности судили по выходу замкнутых кольцевых молекул. Сначала Шор и Болдвин ограничились природными молекулами, затем привлекли методы генной инженерии, что позволило исследовать очень короткие цепи, содержащие всего 200 пар. Поначалу получавшаяся картина радовала исследователей – она соответствовала теории и здравому смыслу. Для очень длинных молекул, содержащих много куновских сегментов, вероятность замыкания падала с ростом длины цепи. Наоборот, для коротких молекул вероятность падала с уменьшением длины. Это вполне понятно, так как длинные молекулы подобны траектории человека, заблудившегося в лесу (см. главу 3), а короткие подобны резиновой дубинке – чем короче дубинка, тем труднее ее согнуть в кольцо.

Одно обстоятельство смущало исследователей. По мере уменьшения длины резко увеличивался статистический разброс результатов, хотя опыты с короткими ДНК ставились не менее тщательно, чем с длинными. В чем дело? Чтобы разобраться в этой неприятной ситуации, Шор и Болдвин приготовили, используя методы генной инженерии, набор образцов, содержащих молекулы из 237, 238 и т. д. до 255 пар нуклеотидов. Когда они измерили для каждого препарата вероятность образования кольцевых цепей и нанесли их на график, то получили отрезок синусоиды с периодом в 10 пар. Стала ясна причина разброса точек. К разбросу приводили вовсе не случайные выбросы, а регулярные осцилляции, связанные со спиральным строением ДНК.

Чтобы понять результат этих важных опытов, представим себе, что мы имеем дело с кольцевой ДНК, одна из цепей которой порвана, и молекула предоставлена самой себе в растворе. Как будет выглядеть ситуация в месте разрыва? Может оказаться, что два конца разорванной цепи готовы к стыковке, как показано на рис. 39а. Но возможно и совсем неблагоприятное взаимное расположение концов, как показано на рис. 39б.

Рис. 39. Два предельных случая стыковки кольцевой молекулы ДНК в месте эдноцепочечного разрыва: а – удачная стыковка: б – неудачная

Представим себе теперь, что мы добавили ДНК-лигазу, которая залечивает разрывы. Фермент может сделать свое дело, только если разорванные края подходят друг к другу «стык в стык». Что же, он зашьет только такие молекулы, как на рис. 39а? Нет, не только. Дело в том, что молекула ДНК – это все-таки микроскопический объект. Одна из принципиальных особенностей микрообъектов, отличающая их от макрообъектов, к которым мы привыкли в повседневной жизни, состоит в том, что микрообъекты испытывают значительные изменения своей формы и размеров вследствие просто теплового движения. В нашем макромасштабе эти изменения незаметны, мы их просто не видим.

В свое время уже шла речь о том, что тепловое движение изгибает линейную ДНК, не дает ей вытянуться, как спице. Оно же не дает кольцевой ДНК принимать энергетически наиболее выгодную форму окружности. Молекула принимает в пространстве причудливую, постоянно меняющуюся форму. Кроме того, в результате теплового движения постоянно меняется угол поворота между соседними парами оснований в двойной спирали. Вследствие теплового движения в опытах Шора и Болдвина лигаза залечивала разрывы не только в случае идеальной стыковки, изображенной на рис. 39а, но и в неблагоприятном случае (рис. 39б), и во всех промежуточных ситуациях. Разница состояла лишь в том, что вероятность замыкания была максимальной в случае, изображенном на рис. 39а, и минимальной для случая, изображенного на рис. 39б. Синусоидальные изменения вероятности замыкания, следовательно, отражали вращение одного конца в месте разрыва относительно другого конца из-за спиральной природы ДНК при удлинении молекулы. Период этой синусоиды соответствовал периоду двойной спирали. Так Шору и Болдвину удалось наглядно продемонстрировать спиральное строение ДНК и оценить период спирали. В дальнейшем Д. Горовиц и Дж. Уонг определили из данных для коротких колец период спирали с очень высокой точностью. Он оказался равным 10,54, в полном соответствии с результатами опытов Уонга.

Замечательной чертой результата Уонга, так же как и опытов Шора и Болдвина, является то, что он получен для изолированных молекул в растворе. Ведь со времени классической работы Р. Франклин все сведения о детальной структуре ДНК основывались на рентгеновских данных для волокон, в которых молекулы сильно взаимодействуют друг с другом.

Итак, ДНК в растворе находится в В-форме – в этом теперь уже нет никаких сомнений. Но это относится к несверхспирализованной ДНК. При сверхспирализации структура основной части молекулы не меняется заметным образом, но некоторые участки с характерными последовательностями могут радикально менять свою структуру. Вспомним про перевертыши и кресты, существование которых доказано экспериментально. А какие еще изменения структуры ДНК могут происходить? Прежде чем обратиться к этим темам, мы рассмотрим фундаментальный вопрос о том, какие силы удерживают две комплементарные цепочки вместе в двойной спирали.

Ответ на вопрос, поставленный в конце предыдущего раздела, может показаться тривиальным. В самом деле, очевидно, что те силы, которые обеспечивают образование комплементарных пар, А•Т и Г•Ц (рис. 38), и удерживают две цепочки друг около друга. Речь идет о так называемых водородных связях (Н-связях). Эти связи по своей силе занимают промежуточное положение между ковалентными связями, соединяющими атомы в молекулы, и чисто межмолекулярными взаимодействиями. Н-связи играют огромную роль и в ДНК, и в РНК, и в белках, и просто в чистой воде, особенно во льду. Именно способность молекул Н₂О образовывать друг с другом Н-связи обусловливает многие аномальные свойства воды, делающие ее столь необычной субстанцией.

Итак, кажется очевидным, что именно Н-связи между комплементарными основаниями удерживают две цепочки ДНК вместе. Так долгое время и считалось. В главе 3 было рассказано о плавлении ДНК, т. е. о расхождении комплементарных цепей при нагревании раствора ДНК. В полном соответствии с представлением о том, что водородные связи удерживают комплементарные цепи друг с другом, ДНК с большим содержанием Г•Ц-пар плавится при более высокой температуре. В самом деле, именно это и следовало ожидать, ведь в Г•Ц-паре имеется три Н-связи, а в А•Т-паре – только две (рис. 38). Причем температура плавления ДНК растет строго линейно с увеличением доли Г•Ц-пар в молекуле. Эта строго линейная зависимость ясно свидетельствовала о том, что стабильность участка двойной спирали зависит только от количества Н-связей в участке и не зависит от того, как Г•Ц – и А•Т-пары распределены вдоль цепи.