Трещина в мироздании - читать онлайн книгу. Автор: Сэмюел Стернберг, Дженнифер Даудна cтр.№ 27

Фермент Csn1 называли по-разному, пока летом 2011-го за ним окончательно не закрепилось название Cas9. И хотя уследить за сменами его названия становилось все сложнее по мере того, как я все глубже погружалась в изучение существующей литературы о Cas9, я была уверена в неоспоримой важности этого белка. Работа Родольфа и Филиппа 2007 года показала, что дезактивация гена, кодирующего белок Cas9, нарушает способность S. thermophilus отражать атаки вирусов. Более того, когда Жозиан и Сильвен обнаружили, что геномы фагов разрезаются во время иммунного ответа CRISPR, они также открыли, что дезактивация гена, кодирующего Cas9, не дает CRISPR уничтожить вирусную ДНК. Подобным образом в опытах Эммануэль с S. pyogenes мутации в гене, кодирующем Cas9, приводили к дефектам в выработке молекул РНК CRISPR и в целом вредили работе иммунной системы. Наконец, результаты работы, проведенной Родольфом и Филиппом осенью 2011 года в лаборатории Виргиниюса Шикшниса, предполагали, что cas9 – единственный известный рабочий cas-ген в системе CRISPR S. thermophilus, абсолютно необходимый для противовирусного ответа.

Чем больше я читала об этом, тем яснее становилось, что белок Cas9, скорее всего, играет ключевую роль на том этапе иммунного ответа систем CRISPR II типа, который связан непосредственно с разрушением ДНК. Это белок был совершенно необходим в бактериях рода Streptococcus, однако казалось разумным, что любой критически важный компонент одной из групп систем II типа будет критически важен и для всех других. Однако какую именно роль играл Cas9, еще только предстояло определить.

Мы с Мартином позвонили Эммануэль по скайпу, чтобы начать строить стратегию наших экспериментов с Cas9. Выбрать момент для этого звонка было непросто, и это лишь подчеркивало организационные сложности нашего сотрудничества. Сама Эммануэль находилась в университете Умео в Северной Швеции, в десяти часовых поясах от Калифорнии, а Кшиштоф Чилински, аспирант, отвечавший за проект ее лаборатории по изучению CRISPR, работал в Венском университете (где раньше располагалась лаборатория Эммануэль). В общем, нам предстояло согласовать работу международной команды: французский профессор в Швеции, польский аспирант в Австрии, а в Беркли – немецкий магистрант, чешский постдок и американский профессор.

Когда удобное для всех время было найдено, мы начали в общих чертах обсуждать предстоящий проект. Мы у себя в лаборатории сначала представляли себе движение к цели весьма прямолинейным: нам нужно понять, как выделить и очистить белок Cas9, – чего пока не смогли сделать в лаборатории Эммануэль. Получив белок Cas9, мы могли бы начать биохимические опыты, чтобы узнать, взаимодействует ли Cas9 с РНК CRISPR (мы предполагали, что да), а также понять, что он делает во время противовирусного иммунного ответа.

Кшиштоф, магистрант Эммануэль, прислал нам искусственную хромосому, содержащую ген cas9 из S. pyogenes, а Михи принялся за работу над очищением белка под пристальным контролем Мартина. Сначала Михи помещал синтетическую ДНК в различные штаммы E.coli, а затем, варьируя условия роста и типы питательных сред, последовательно проверил десятки различных параметров, чтобы подобрать протокол, при котором получается максимальное количество белка Cas9 (словно садовник, пробующий различные комбинации почв и удобрений, чтобы определить оптимальные условия для роста нового цветка). Затем с помощью хроматографии (эта технология позаимствована из химии) Михи протестировал различные методы “вскрытия” клеток и отделения Cas9 от других клеточных белков. Наконец, он определил стабильность очищенного белка Cas9. Некоторые белки капризнее других и портятся после одного лишь применения – обычно они слипаются друг с другом и выпадают в осадок, подобно микроскопическим снежинкам, из-за чего совершенно прозрачная пробирка с белковым раствором становится молочного цвета. Другие же молекулы демонстрируют замечательную выносливость – например, их можно неоднократно замораживать и размораживать. Нам повезло: Cas9 относился ко второй категории.

Наконец, пришло время провести первый биохимический опыт. Когда Михи и Мартин выделяли и очищали белок Cas9, мы предположили, что проявление любой связанной с разрезанием ДНК активности, свойственной конкретному белку, зависит от наличия РНК CRISPR. В системах CRISPR I типа, которые изучали в нашей лаборатории, РНК CRISPR собиралась вместе с множеством Cas-белков для формирования машины для соединения с ДНК и ее разрезания. Мы предполагали, что Cas9 может работать с РНК CRISPR подобным образом. В соответствии с этой идеей компьютерный анализ последовательности аминокислот Cas9 показал возможное присутствие не одной, а двух отдельных структур для разрезания нуклеиновых кислот, или нуклеаз, внутри фермента. Возможно, один или оба эти участка были способны резать ДНК фага.

Так как время Михи в лаборатории уже подходило к концу (ему нужно было вернуться в Германию, чтобы доделать диссертацию, и билет на самолет был уже куплен), они с Мартином поставили перед собой задачу выяснить, способен ли очищенный фермент Cas9 разрезать ДНК. Синтезировав рабочую молекулу РНК CRISPR, которую идентифицировала Эммануэль во время работы над S. pyogenes, они смешали РНК CRISPR, белок Cas9 и образец ДНК. Что важно, использованная в экспериментах ДНК содержала последовательность “букв”, совпадающих с последовательностью на одном из концов РНК CRISPR.

Как это часто бывает в науке, этот эксперимент обернулся разочарованием. Никаких изменений в ДНК не наблюдалось; после воздействия Cas9 и комплементарной РНК CRISPR она оставалась точно такой же, как и до этого. Либо Михи не выполнил эксперимент с должной аккуратностью, либо Cas9 все-таки был лишен способности разрезать ДНК. Михи представил результаты сотрудникам лаборатории и в несколько подавленном настроении отправился домой, уверенный, что целое лето, занятое сложной работой по выделению, очищению и изучению Cas9, потрачено впустую.

Пока наше сотрудничество с Кшиштофом и Эммануэль еще только набирало обороты, Мартин курировал работу Михи в лаборатории, но также продолжал поиски вакансии преподавателя. Он проходил собеседования по всему миру – в том числе, например, в Швейцарии (где он в конце концов и станет доцентом в Цюрихском университете). Однако, к счастью для нас, к тому моменту, когда Михи отправился домой, график поездок Мартина тоже стал значительно менее напряженным, поэтому он смог продолжить начатое Михи, полностью сосредоточившись на Cas9 – и на поисках ответа на вопрос, в чем именно заключается функция этого белка.

Работа Михи и Мартина вроде бы показывала, что Cas9 неспособен разрезать ДНК, однако, возможно, что-то было не так с самим экспериментом? Возможностей было множество: от тривиальных (например, белок мог распасться в пробирке) до более сложных (например, мог отсутствовать необходимый компонент реакции). Чтобы проверить эту вторую версию, Мартин и Кшиштоф начали пробовать различные способы проведения эксперимента по разрезанию ДНК. Благодаря очередной забавной случайности, которых полна эта история, они узнали, что выросли практически через границу друг от друга: Кшиштоф – в Польше, а Мартин – в стране, которая тогда называлась Чехословакия. Оба они говорили по-польски, что стало отличным подспорьем для все более частых разговоров по скайпу, в ходе которых они обменивались мыслями о своих экспериментах.