Трещина в мироздании - читать онлайн книгу. Автор: Сэмюел Стернберг, Дженнифер Даудна cтр.№ 13

Начиная с середины 1990-х, пока я разбиралась со структурами молекул РНК с их уникальным биохимическим поведением, другие ученые спешили разработать новые системы, которые, подобно I-SceI, могли бы направленно действовать на конкретные последовательности ДНК. Тот, кому удалось бы решить эту проблему, смог бы раскрыть весь потенциал редактирования генома.

К этим технологиям нового поколения предъявлялось три критически важных требования: они должны были распознавать определенную выбранную последовательность ДНК; уметь разрезать эту последовательность и легко подвергаться перепрограммированию, для того чтобы атаковать различные последовательности ДНК и инициировать их разрыв. Первые два условия были необходимы для создания двуцепочечных разрывов, а третье – для того, чтобы этот инструмент был максимально универсален. I-SceI превосходно отвечала двум первым критериям, однако совершенно не соответствовала третьему. Биоинженеры поняли: чтобы создать программируемую систему разрезания ДНК, нужно либо перестроить I-SceI таким образом, чтобы она могла атаковать разные последовательности, либо найти совершенно новую нуклеазу, которая уже “научилась” разрезать самые различные последовательности ДНК.

Попытки ученых видоизменить I-SceI не достигли цели (что и неудивительно, учитывая крайне сложное молекулярное устройство белков-ферментов), и вскоре стало ясно, что поиск других природных нуклеаз – гораздо более перспективный подход. Фактически, к тому моменту, когда Джесин вела свои эксперименты с I-SceI, ученые уже выделили десятки нуклеаз из целого ряда организмов и установили конкретные последовательности ДНК, служившие мишенями для этих ферментов. Однако существовала фундаментальная проблема: подавляющее большинство ферментов распознавали последовательности длиной лишь в 6 или 8 “букв” – то есть слишком короткие для того, чтобы с таким ферментом можно было работать. В геноме человека подобные последовательности встречаются десятки или даже сотни тысяч раз, и это означает, что, даже если нуклеаза способна стимулировать гомологичную рекомбинацию в одном гене, она в процессе может “порубить” почти весь геном. Клетка была бы разрушена еще до того, как у нее появится какой-либо шанс начать репарацию ДНК.

Исследователи не могли положиться ни на одну из ранее открытых нуклеаз, а поиск нового фермента, подобного I-SceI, для каждой новой попытки редактирования генома – задача совершенно неосуществимая. Если вы хотите превратить терапевтическое редактирование генома в эффективную технологию исправления болезнетворных мутаций, то медики не могут в каждом случае ждать, пока вы обнаружите нуклеазу, которая бы избирательно действовала именно на тот участок заданного гена, в котором у конкретного пациента вредоносная мутация. Вам необходима возможность “взять с полки” подходящую нуклеазу из уже открытых – или по крайней мере технология, позволяющая создавать нужные нуклеазы по мере необходимости.

Революционное исследование, предложившее решение этой проблемы, было проведено в 1996 году, хотя я тогда о нем не знала. Шринивасан Чандрасекаран, профессор из Университета Джонса Хопкинса, понял, что вместо создания нуклеаз “с нуля”, поиска новых в природе или переделывания I-SceI можно избрать смешанный подход: выбирать фрагменты существующих белков и комбинировать их. Такие химерные нуклеазы отвечали бы двум первым требованиям к редактирующей геном нуклеазе: они были бы способны распознавать определенную выбранную последовательность ДНК и делать в ней разрез.

Чандрасекаран решил собрать химерную нуклеазу из фрагментов двух встречающихся в природе белков, которые отлично справлялись с распознаванием и разрезанием последовательностей ДНК соответственно. Для разрезания Чандрасекаран выбрал участок бактериальной нуклеазы под названием FokI, который мог инициировать разрывы в ДНК, но не обладал предпочтениями к каким-либо последовательностям. А для “нацеливания” он приспособил повсеместно распространенные натуральные белки с цинковыми пальцами (ZFN), названные так потому, что они распознают ДНК, используя похожие на пальцы структуры, связанные ионами цинка и расположенные рядом друг с другом подобно пальцам на руке. Так как эти белки с цинковыми пальцами состоят из многократно повторяющихся, тандемно расположенных участков и каждый участок распознает определенную последовательность из трех “букв” ДНК, казалось вероятным, что ученые могут видоизменить эти белки, комбинируя фрагменты по-разному, чтобы они распознавали различные последовательности ДНК.

Удивительно, но химерная нуклеаза, судя по всему, сработала ^[36]. Соединив “режущий” фрагмент FokI с распознающим ДНК участком белка с цинковыми пальцами, команда Чандрасекарана продемонстрировала, что искусственно составленная нуклеаза распознавала и резала именно ту ДНК, что ожидали ученые, – даже несмотря на то, что они смешали два белковых компонента из совершенно различных источников.

Вскоре Чандрасекаран пригласил к сотрудничеству профессора университета Юты Дану Кэрролл, чтобы использовать эти новые нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN) в более прикладных целях. Вместе они продемонстрировали, что ZFN работают и в яйцеклетках лягушки ^[37] (популярной среди биологов модельной системе) и что сделанные ZFN разрывы в ДНК стимулировали гомологичную рекомбинацию. Затем, работая с плодовыми мушками, сотрудники лаборатории Даны Кэрролл сумели запрограммировать новую ZFN на направленное воздействие на ген yellow (один из генов, определяющих окраску тела) и показали, что эта стратегия может обеспечить заданное генетическое изменение во всем организме ^[38]. Это был очень важный шаг в развитии редактирования генома. ZFN проявили себя не только подходящими для применения в организмах животных; что более важно, их оказалось можно видоизменить таким образом, чтобы их мишенями стали другие, новые гены.

Научное сообщество вскоре подхватило эстафету, и исследователи начали разрабатывать ZFN под собственные цели, выбирая в качестве мишеней новые гены и работая с новыми модельными объектами. В 2003 году Мэттью Портеус и Дэвид Балтимор первыми показали: ген в клетке человека можно редактировать с высокой точностью, используя специально созданную ZFN ^[39]. Вскоре после этого Федор Урнов и его коллеги исправили в клетках человека мутацию, вызывающую сцепленный с X-хромосомой ТКИД ^[40]. Возможности использования редактирования генома для направленного воздействия на наследственные заболевания еще никогда не казались настолько близкими к реальности.