Расшифрованная жизнь. Мой геном, моя жизнь - читать онлайн книгу. Автор: Крейг Вентер cтр.№ 32

Как и в геномной библиотеке, каждый том комплементарной библиотеки должен быть представлен в удобном для обработки и копирования виде. Природа решила и эту проблему. Комплементарные библиотеки ДНК получают путем выделения матричных РНК в тканях, преобразуют эти РНК в комплементарные фрагменты ДНК и встраивают их в плазмиды, небольшие кольцевые молекулы ДНК с инструкциями для бактерии. Бактерии кишечной палочки E. coli, инфицированные этой кДНК, играют роль «печатного станка» книг для этой библиотеки. Каждая бактерия содержит соответствующий сегмент кДНК человека, и когда бактерия реплицируется (делится на дочерние клетки), то и материнские, и дочерние клетки получают одинаковые фрагменты гена человека.

Эти фрагменты ДНК невидимы для невооруженного глаза, но их легко разглядеть с помощью специальных приборов. На дно чашки Петри наносят очень тонким слоем, чтобы по возможности избежать соприкосновения колоний бактерий, бульон с E. coli, содержащими кДНК человека. Отдельные колонии бактерий начинают расти, и когда они в итоге становятся различимы глазом в виде пятен, в каждой из них оказываются миллионы идентичных бактериальных клеток (клонов), и в каждой из этих клеток находится одинаковая часть кДНК человека. В небольшой чашке Петри можно получить десятки и сотни тысяч таких изолированных колоний и создать обширную библиотеку ДНК человека.

С помощью любой из таких библиотек мы начинаем охоту на рецептор, используя способ крепления комплементарных ДНК. Фильтровальной бумагой удаляем ДНК из чашек Петри с E. coli, вырастившей геномную или комплементарную библиотеку ДНК. Фильтровальную бумагу затем замачиваем на ночь в растворе рецепторного ДНК-зонда. Чтобы определить, связан ли он с комплементарной ДНК в библиотеке, зонд метят радиоактивным изотопом фосфора Р-32, заменяя им некоторые атомы фосфора в молекуле ДНК. Затем фильтры промывают, чтобы удалить все следы радиоактивного зонда, которые не присоединились ни к одному из фрагментов ДНК, сушат и помещают на несколько дней в кассету с рентгеновскими пленками. Положительные колонии и бляшки – области, где радиоактивный зонд прикрепился к целевой ДНК-мишени, видны на проявленной рентгеновской пленке как черные пятна. Сравнивая пятна на пленке с пятнами в чашке Петри, положительные колонии или бляшки можно идентифицировать, а затем выделить и амплифицировать их ДНК.

Заметим, что найти нестабильную матричную РНК, кодирующую определенные белки, не так-то просто. В каждой клетке есть всего несколько тысяч молекул трудно выделяемых мембранных белков, например адреналиновых рецепторов. Как следствие, невелико также и количество матричной РНК, кодирующей рецепторный белок. Используя генетический материал мозга человека, полученный для медицинских исследований, нам приходилось изучать более миллиона колоний кДНК, чтобы найти именно ту, которая содержала матрицу для создания адреналинового рецептора. Мы вырастили колонию для производства достаточного количества такой ДНК и с ее помощью сумели ее секвенировать – определить порядок расположения четырех нуклеотидов (C, G, A и T), формирующих звенья в молекуле ДНК с внешним остовом из сахара и фосфата. Порядок расположения пар оснований в ДНК определяют с помощью двух основных методов секвенирования. Один из них был разработан в Лаборатории молекулярной биологии Совета по медицинским исследованиям в Кембридже Фредериком Сенгером, блестящим ученым, (кстати, разделяющим мою любовь к парусному спорту) ^{15}, который однажды сказал, что «у него все в порядке с головой, но не очень хорошо с болтовней». Второй был описан гарвардским ученым Уолли Гилбертом, известным как «серый кардинал с грандиозными замыслами». В 1980 году Гилберт и Сенгер получили Нобелевскую премию. Большинство экспериментов по секвенированию, проведенных в последние десятилетия, являются прямым продолжением именно метода Сенгера, которому удалось разрешить некоторые сложнейшие проблемы биологии. В мае 1975 года Сенгер потряс научный мир, частично секвенировав ДНК, а затем впервые полностью секвенировав геном вируса: 5375 пар оснований генетического кода бактериофага phi-X174. Позднее Сенгер секвенировал приблизительно 17 тысяч (или около того) пар оснований ДНК митохондрий человека (энергетических фабрик наших клеток), положив начало первому проекту по расшифровке генома человека.

Метод расшифровки ДНК, впервые предложенный в Кембридже Сенгером совместно с Аланом Коулсоном, состоит в создании многочисленных копий молекул ДНК с использованием фермента ДНК-полимеразы. Для репликации ДНК этой полимеразой ее помещают в раствор из нуклеотидов – строительных блоков ДНК. Фермент считывает информацию с каждого конца первичной нити ДНК, используя нуклеотиды для создания новых копий. Вклад Сенгера состоял в добавлении в этот раствор дополнительного ингредиента – «нуклеотидов-терминаторов», помеченных радиоактивным P-32. Эти нуклеотиды присоединяются к растущей копии и случайным образом прекращают действие полимеразы, помечая конец растущей цепи радиоактивной меткой. Поскольку это может происходить на любой стадии образования в пробирке множества копий молекул ДНК, в результате образуется смесь фрагментов ДНК различной длины, каждый из которых оканчивается радиоактивно помеченными C, G, А или T, – смотря по тому, какое основание помечено P-32.

Затем фрагменты пропускают через слой геля, на котором молекулы ДНК под действием электрического поля разделяются в зависимости от размера. Теперь можно прочитать последовательность, поскольку более крупным фрагментам ДНК требуется больше времени для прохождения через гель. Поскольку метки на всех четырех нуклеотидах – C, G, A, T – одинаковы и оставляют одинаковый след в виде черных полосок на рентгеновской пленке, необходимо проводить четыре отдельных эксперимента, по одному на каждую букву кода. После использования ДНК-полимеразы для каждого из четырех нуклеотидов-терминаторов (в одной серии опытов помечены все C, в другой – все G, и так далее), их помещают на четыре соседние дорожки на том же самом геле. Когда фрагменты разделяются, одна дорожка демонстрирует фрагменты ДНК, оканчивающиеся на С, другая – оканчивающиеся на G, и так далее.

Гель высушивают, выдерживают несколько дней на рентгеновской пленке, оставляя четыре параллельные дорожки с черными полосками, потом внимательно изучают пленку, начиная с первой из четырех дорожек. Так и получают искомую последовательность, записывая по порядку каждую следующую букву сотни раз для каждого образца. Это трудоемкий и длительный процесс, в течение которого могут происходить – и происходят – всяческие сбои. Если одна из четырех реакций на геле не получилась, весь эксперимент идет насмарку; нередко случается, что дорожки располагаются не параллельно друг другу. Это затрудняет сравнивание черных меток и пробелов на каждой из дорожек и считывание всей последовательности. При высыхании гель может растрескаться, и часто именно так и происходит. Реагенты могут разлагаться, и это тоже часто у нас случалось…

Меня очень раздражала возможность различной интерпретации результатов – я часто видел, как выводы делались не столько на основании полученных данных, сколько в силу авторитета или в интересах какого-нибудь ученого. Я же хотел получить истинные данные, основанные на эксперименте. Последовательность либо есть, либо ее нет. Она либо точна, в пределах погрешностей метода, либо нет – как правило, в результате неряшливости опыта.