Расшифрованная жизнь. Мой геном, моя жизнь - читать онлайн книгу. Автор: Крейг Вентер cтр.№ 31

На словах все выглядит несложно, но на это ушло десять лет изнурительного труда! Благодаря усилиям моим и моих сотрудников, та же самая работа сейчас занимает всего несколько дней. Но вернемся в 1980-е годы, к тяжелой и кропотливой работе по выделению и изучению редких белков, образующихся в организме человека. Для выделения количеств рецепторного белка, необходимых для определения гена, я хотел использовать недавно разработанный тогда метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Этот метод заключается в том, что компоненты мембраны клеток человека (в данном случае) помещают в раствор детергента для разложения липидов, а затем раствор с выделенными из мембраны белками пропускают через колонки с насадкой. Скорость прохождения белка по колонке зависит от его размера или заряда, при этом молекулы небольшого размера проходят быстрее, чем более крупные.

Для использования этой новой методики нужны были опытные специалисты. Я пригласил на работу Энтони Керлаваджа, который вместе со Сьюзен Тейлор из Калифорнийского университета в Сан-Диего занимался очисткой белков методом ВЭЖХ. А для дальнейшего совершенствования методов изучения белков я сформировал команду молодых специалистов, в которую вошел постдок из Северной Каролины Фу-Зон Чунг и два лаборанта из Буффало – Жанин Гокейн и Майкл Фитцджеральд.

За время освоения процессов очищения рецепторов мы опубликовали тридцать научных работ по различным аспектам изучения структуры и функции рецепторов. В итоге мы сделали важный вывод: природа очень неизобретательна при конструировании рецепторов и все время использует одни и те же модели, разве что с незначительными изменениями. Анализ структуры мускариновых ацетилхолиновых рецепторов (подтип ацетилхолиновых рецепторов) и альфа-адренергических рецепторов (тип адреналинового рецептора) показал значительное сходство структур, несмотря на то, что рецепторы распознают совершенно разные нейромедиаторы в организме. Этот вывод оказался весьма неожиданным, поскольку ранее в молекулярной биологии различные рецепторы рассматривались как существенно отличающиеся объекты, поэтому многие исследователи пренебрежительно отнеслись к нашим данным, и лишь недавно, когда гены рецепторов были секвенированы, их значительное сходство стало очевидным.

За два года мы добились значительных успехов, но в тот момент, когда цель была близка и мы начали секвенировать аминокислоты, выделив и очистив крайне небольшое количество рецепторов, конкуренты нанесли по нам сокрушительный удар. Нас опередила группа ученых из Дьюкского университета под руководством Роберта Лефковича, они даже получили за это премию. Работая вместе со специалистами фармацевтической компании Merck, они приложили большие усилия для очищения и клонирования рецепторов адреналина из красных кровяных телец клеток индюшек. Триумф Лефковича взволновал всех ученых, работавших в этой области. Ну и меня, разумеется. Я собрал своих сотрудников и напомнил им, что это только начало, и главные открытия впереди.

Для дальнейших исследований мы решили воспользоваться способом, с помощью которого соединяются попарно комплементарные основания в генетическом коде – каждая половина двойной спирали. Еще в 1953 году Уотсон и Крик догадались, как отдельные цепочки ДНК копируются в комплементарную цепь при объединении оснований в пары. Это одновременно объясняет, как при делении клетки копируются ДНК в хромосомах. Изучив все четыре азотистых основания генетического алфавита, они обнаружили, что А всегда объединяется в пару с G, а C с Т. После разделения двойной спирали на две дочерние комплементарные к ним цепочки образуются по этим правилам. И если создать одну цепочку оснований, то по тем же правилам она соединится только с комплементарной цепочкой. По сути мы создаем ДНК-зонд, который крепится только к определенному гену на огромном геноме человека.

Мы могли бы использовать этот способ комплементарного соединения оснований, применив два подхода к определению генетического кода адреналинового рецептора. Во-первых, использовать небольшую часть последовательности белкового рецептора, полученную нами для расшифровки соответствующей последовательности ДНК, в качестве зонда для поиска определенных генов в геноме человека. Во-вторых, воспользоваться наследием эволюции: гены адреналинового рецептора индюшки и человека, скорее всего, должны быть довольно схожими. Другими словами, мы могли бы сделать ДНК-зонды из самого гена индюшки, – если они свяжутся с комплементарными ДНК человека, они выявят эквивалентный ген человека. Помещая радиоактивную метку на разные виды зондов, мы таким образом установили бы место присоединения каждого из меченых зондов.

Но, как обычно, возникли проблемы. Нужно было получить геном человека в форме, пригодной для этих экспериментов. Даже в виде хромосом, то есть в том виде, в котором он находится в клетках, размер этого кода слишком велик для исследований. Для успешной «охоты на гены» необходимо разделить генетический код человека на пригодные для работы участки. Если взять полный набор ДНК в клетке человека и разделить его на части, то в итоге получится то, что ученые называют «библиотекой». Существуют два основных типа библиотек ДНК – геномные и клоновые.

Геномная библиотека ДНК создается с помощью специальных ферментов, называемых рестриктазами, которые разрезают хромосомы человека на мелкие кусочки, каждый из них состоит примерно из 15–20 тысяч пар оснований ДНК. Чтобы изучать эти части ДНК человека, нужно уметь их копировать и хранить, точно так же, как книги – печатать и переплетать. В процессе копирования каждый фрагмент ДНК человека прикрепляется к ДНК бактериофага – вирусу, который инфицирует бактерии и размножается внутри них. Такой обработанный бактериофаг, несущий в себе ДНК человека, используют для инфицирования бактерии кишечной палочки E. coli. Если налить в чашку Петри бульон с инфицированной кишечной палочкой E. coli, то на бактериальном газоне появятся стерильные пятна – там, где вирусы убили E. coli. Эти пятна, бляшки, содержат миллионы вирусных частиц – и следовательно, миллионы копий фрагментов ДНК человека.

Клоновые библиотеки ДНК составляют на основе другого генетического материала в клетках – матричной (информационной) РНК, переносящей геномную информацию для сборки белка. Только 3 % нашего генетического кода отвечает за кодирование белков, поэтому мы получаем гораздо более компактный «рабочий чертеж» ДНК человека, если сосредоточим внимание на РНК, кодирующую эти белки. (Типичный ген может содержать миллион пар оснований, а длина «отредактированной» РНК может доходить всего лишь до тысячи пар оснований.) Другими словами, такая библиотека ДНК использует тот же способ, с помощью которого природный «издатель» превращает весь генетический код в гораздо меньшие матричные РНК – лишь субпопуляции генов, необходимых для создания специфичных клеток или тканей.

По своей природе матричная РНК недолговечная и нестабильная молекула, в противном случае мы бы просто выделили ее из клетки и прочитали. Однако с помощью фермента «обратная транскриптаза» РНК нетрудно скопировать в стабильную молекулу ДНК. Это называется комплементарной ДНК или кДНК. Выделяя РНК человека для изготовления кДНК, мы получаем сжатый, легко читаемый вариант генома с кодирующими белок генами.