Сумма биотехнологии. Руководство по борьбе с мифами о генетической модификации растений, животных и людей - читать онлайн книгу. Автор: Александр Панчин cтр.№ 50

Эти три варианта разбиения последовательности на кодоны называются рамками считывания. На практике синтез белка пойдет только по одной из трех рамок, потому что рибосома начинает синтез не со случайного места, а с конкретного старт-кодона. У эукариот обычно старт-кодоном выступает самый первый кодон AUG (ближайший к 5’-концу), он кодирует метионин. У прокариот, как правило, старт-кодоном выступает AUG, на расстоянии около восьми нуклеотидов от которого есть особая последовательность Шайна — Дальгарно. Обычно она содержит фрагмент AGGAGG. Генным инженерам важно понять, какая рамка считывания будет использоваться. Если мы хотим получить гибридный белок, оба гена должны оказаться в одной рамке считывания.

Кроме того, нужно учитывать, что первый ген, за которым мы встраиваем второй, имеет стоп-кодон. На стоп-кодоне синтез белка заканчивается, и дальнейшая последовательность нуклеотидов значения не имеет. Для того чтобы получился гибридный белок, нужно либо убрать этот стоп-кодон, либо вставить второй ген до него. Теперь, когда мы поняли, как создавать гибридные белки, давайте разберемся, как нам заставить бактерию производить чистый флуоресцентный белок.

Возьмем ген флуоресцентного белка и вставим его в геном бактерии между двумя другими генами, так чтобы он их не задевал. Для того чтобы ген работал, необходимо, чтобы с него считывалась молекула РНК. Для этого перед геном должен располагаться специальный участок, который называется промотор. Фермент РНК-полимераза связывается с промотором, а затем начинает перемещаться вдоль молекулы ДНК (строго в одном направлении, от 5’-к 3’-концу), синтезируя комплементарную молекулу РНК, которая впоследствии станет инструкцией для синтеза белка.

Место начала считывания РНК у бактерий определяется так: за 10 нуклеотидов до него должен быть участок с последовательностью, похожей на TATAAT, а за 35 нуклеотидов — участок, похожий на TTGACA. У эукариотических организмов все сложнее, и мы поговорим о них позже.

В предыдущем примере генной инженерии нас не волновало наличие промотора, ведь у исходного гена, к которому пристроили ген зеленого флуоресцентного белка, бактериальный промотор уже был. Промотор должен быть перед любым местом в геноме, с которого считывается РНК. Но у нашего гена медузы нет собственного бактериального промотора, и вставили мы его в произвольное место, а не туда, где он непременно есть. Необходимый промотор проще всего вставить сразу вместе с геном. Берем бактерий, выделяем из них ДНК, вырезаем из этой ДНК участок промотора, присоединяем промотор к гену медузы, а затем вставляем всю конструкцию в геном живой бактерии. Альтернативно промотор или конструкцию целиком можно синтезировать на специальном химическом синтезаторе.

Теперь у нас в романе «Война и мир» появились чистокровные марсиане. «Андрей Болконский проснулся и выглянул в окно. За окном находился огромный металлический цилиндр. Большая сероватая круглая туша, величиной, пожалуй, с медведя, медленно, с трудом вылезала из цилиндра», а продолжение вы знаете.

Давайте теперь усложним задачу. Мы хотим, чтобы флуоресцентные белки медузы появлялись в тех бактериях, которых мы покормили сахаром, а точнее конкретным видом сахара — лактозой. Для этого нам потребуется несколько дополнительных генетических конструкций, которые мы позаимствуем у кишечной палочки. Сначала мы добавляем к гену флуоресцентного белка регуляторную последовательность — оператор. Когда оператор свободен, синтез белка происходит, а когда оператор заблокирован, зеленый белок не появляется. Дополнительно мы встраиваем еще один ген, кодирующий белок-репрессор. Этот белок может связываться с оператором и таким образом останавливать синтез зеленого белка. Механизм действия репрессора такой: он мешает РНК-полимеразе присоединиться к молекуле ДНК, что предотвращает синтез РНК. Нет РНК — нет белка.

Мы выбрали не простой репрессор. Как у любого героя романа, у него есть слабость — он любит лактозу и изменяет с ней оператору. Когда в клетке есть лактоза, репрессор связывается с этим сахаром. Оператор остается одиноким, и РНК-полимераза спокойно синтезирует РНК. Когда лактозы нет, репрессор возвращается к оператору и блокирует синтез РНК нашего гена. Поэтому клетка будет светиться зеленым, если в среде есть лактоза, но не будет светиться, если лактозы нет. Так мы получили светящийся датчик лактозы в виде генетически измененной бактерии. Остается лишь поместить бактерию под специальный микроскоп.

Ген белка репрессора и последовательность оператора были лишь обнаружены человеком, но придуманы они были природой. Кишечная палочка использует описанную выше систему, для того чтобы регулировать работу некоторых собственных генов. Когда лактозы много, кишечная палочка производит белок, который расщепляет лактозу на глюкозу и галактозу — два других сахара. Когда лактозы нет, экономной бактерии не нужен этот фермент, и белок-репрессор помогает остановить его синтез.

Давайте и в нашей версии романа «Война и мир» поставим оператор с репрессором. Скопируем перед описанием сцены с марсианами длинный авторский монолог из четвертого тома. Обычный человек, дойдя до этого монолога, уснет и ничего не узнает про марсиан. Но если он вооружится чашечкой крепкого кофе, возможно, сон удастся отогнать, и читатель осилит текст до конца. В нашей конструкции кофе играет роль лактозы у бактерий, сон — роль репрессора, а монолог — роль оператора, навлекающего сон. Нет кофе — нет истории про марсиан.

Можно предложить и другое сравнение. ДНК — это рельсы, по которым едет поезд — молекула РНК-полимеразы. Оператор — это место, где установлен шлагбаум, репрессор — это сам шлагбаум, а роль лактозы выполняет работник, управляющий шлагбаумом. Этот работник — человек важный, поэтому, когда его нет на службе, шлагбаум на всякий случай опущен и поезд вынужден стоять и ждать неопределенное время. Но когда работник возвращается, шлагбаум поднимается. Единственное биологически важное уточнение заключается в том, что репрессор на самом деле не столько мешает РНК полимеразе двигаться по ДНК, сколько не дает ей «встать на рельсы», соединиться с промотором. Поэтому промотор и оператор, как правило, находятся очень близко.

Благодаря различным операторам и репрессорам бактерии могут включать и выключать свои гены в зависимости от условий окружающей среды, от наличия питательных веществ, температуры и так далее. Когда мы говорим о многоклеточных организмах, например о растениях или животных, все становится несколько сложнее. Во всех клетках взрослого растения приблизительно одинаковая ДНК (с небольшими отличиями из-за случайных мутаций), но клетки могут быть совершенно разными. Одни клетки расположены в листьях, и им нужно производить много белков, участвующих в фотосинтезе. Другие расположены в стебле и отвечают за транспорт питательных веществ. Третий тип клеток формирует цветки и должен быть яркоокрашенным, чтобы привлекать опылителей. Возможны десятки и даже сотни разных типов клеток, в которых работают разные гены. И это все должно как-то саморегулироваться.