Расшифрованная жизнь. Мой геном, моя жизнь - читать онлайн книгу. Автор: Крейг Вентер cтр.№ 85

Теперь мы располагались в двух четырехэтажных зданиях с полуподвальными помещениями площадью около 9,5 тысяч м². На первом этаже корпуса № 1 были административные помещения, мой кабинет и кабинеты старших научных сотрудников, второй этаж занимала лаборатория протеомики, а на третьем этаже мы разместили секвенаторы ДНК модели ABI 3700 и организовали небольшие рабочие места для лаборантов. На верхнем этаже проводился анализ ДНК.

Там же начиналось исследование генома, там работал Хэм Смит со своей командой. Он создавал библиотеки последовательностей, используя небулайзер с узким отверстием для распыления раствора ДНК и аккуратно разрезая ДНК хромосом на значительно более мелкие фрагменты. После прохождения через небулайзер, а затем через гели, эти фрагменты ДНК сортировались по размеру. Хэм выделял фрагменты длиной 2 кб (2 тысячи пар оснований), 10 кб и 50 кб. Затем произвольно выбранные фрагменты ДНК встраивали в плазмидные векторы, позволяющие ввести фрагменты ДНК в клетки E. coli, где они размножались миллионы раз. Таким образом мы хотели создать десятки миллионов фрагментов для формирования трех разных библиотек: для фрагментов длиной 2, 10 и 50 кб.

После этого библиотеки передавались в микробиологическую лабораторию, где проводилось высеивание содержимого каждой библиотеки. Бактерии разбавляли до состояния кашицы, которую затем помещали на агар (агар – желеобразное вещество, содержащее основные питательные вещества для роста бактерий) так, чтобы соседние бактериальные затравки находились примерно на расстоянии миллиметра друг от друга. По мере деления клеток бактерий на каждом участке вырастали колонии E. coli, содержавшие фрагменты ДНК. Эти колонии уже на следующий день становились видимыми невооруженным глазом.

Не так давно для получения значительно большего количества ДНК ученые использовали стерильные зубочистки, которыми переносили бактерии из каждой такой колонии в пробирку с питательной средой. В лаборатории, которую мы называли отборочной, мы заменили зубочистки и даже лаборантов большими роботами с прецизионно работающей механической рукой и небольшой ТВ-камерой для наблюдения за колониями. Если бактерии распологались слишком близко, робот не обращал на них внимания, поскольку в таких случаях клоны могли перемешаться. Но если камера ясно видела отдельную колонию, рука робота накалывала ее металлическим зондом и переносила драгоценный груз с ДНК на пластмассовую пластину с 384 лунками, содержащими питательную среду, где бактерии размножались и их количество возрастало в миллионы раз. После каждого накола зонды автоматически очищались, и за один день наши роботы могли обработать более 100 тысяч клонов. За роботами было чрезвычайно интересно наблюдать, и очень скоро они стали излюбленным объектом для съемок приезжавших к нам операторских групп.

Ускорить процесс извлечения ДНК человека из бактерий оказалось одной из самых трудных задач в нашей работе. Сама ДНК человека растет в плазмиде, отделенной от хромосомы бактерии. В типичной молекулярно-биологической лаборатории за один день хороший лаборант может приготовить сотню препаратов плазмид. Чтобы справиться с обработкой огромного потока клонов, поступающих из отборочной лаборатории, нам понадобилась бы тысяча лаборантов.

Глубина лунок на 384-луночных пластинах составляла 3,8 см, но они были очень узкими, что создавало специфические проблемы. Предварительные опыты показали: на дне лунок не хватает кислорода, что ограничивает рост бактерий. Эту проблему наши сотрудники разрешили хитроумным способом, поместив в лунки шарики из нержавеющей стали (размером с дробинку). Затем ряд таких пластин помещали на круглую платформу, медленно вращающуюся вблизи расставленных на разной высоте магнитов. При этом шарики в бактериальной среде то поднимались, то опускались. Перемешивая таким образом содержимое лунок, мы добились равномерного роста бактерий.

А в это время команда наших химиков придумала новый способ, как разрывать клетки бактерий для высвобождения плазмид, содержащих ДНК человека. Помещая 384-луночные пластины в центрифугу, нам удавалось «согнать» остатки бактерий и их ДНК на дно лунок. Плазмиды с их ценным грузом, ДНК человека, при этом оставались в растворе. Затем плазмидную ДНК можно было без труда очистить, экономя более доллара на каждой из 384 лунок наших пластин.

Следующим шагом было присоединение четырех разных красителей к четырем нуклеотидам генетического кода. Мы делали это широко используемым в молекулярной биологии методом амплификации ДНК с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции), применяя который можно копировать ДНК, одновременно добавляя красители. В Cele ra у нас одновременно работало 300 аппаратов ПЦР. Вот теперь мы, наконец-то, были готовы прочитать саму ДНК.

Содержащие прошедшую ПЦР, уже очищенную ДНК 520 наших 384-луночных пластин пропускали через секвенаторы модели 3700, которым предстояло считывать последовательность нуклеотидных пар в генетическом коде. Внутри секвенатора, в тонком капилляре, образец ДНК разделялся на молекулы разного размера. Когда ДНК достигала конца капиллярной трубки, лазер активировал присоединенные красители. Затем с помощью небольшой ТВ-камеры определялся цвет и полученные результаты передавались в компьютер. Это было чрезвычайно важно, так как именно в этот момент последовательность молекулы ДНК преобразовывалась в цифровой код. Четыре химических пары ее нуклеотидов переводились в четыре цвета, а те в свою очередь – в серию единиц и нулей, представляющих четыре генетических нуклеотида. Считывание кажд ого фрагмента ДНК от одного конца до другого позволяло получить от 500 до 600 нуклеотидных пар кода.

Наш процесс заработал. Теперь нам нужно было повторить его 26 миллионов раз и затем заново собрать всю последовательность.

Я понимал, что автоматизация процесса исследования ДНК в сочетании с компьютерным анализом – ключ к пониманию структуры генома человека, уже тогда, когда был разработан метод EST. Еще в 1987 году, когда мы вместе с Джанин Кокейн начали использовать самое первое устройство для секвенирования ДНК, мы с ней стали экспертами по распознаванию изображений в четырехцветных показаниях устройства. Пытаться сопоставить эти изображения в тысячах, не говоря уже о миллионах последовательностей, было, совершенно очевидно, выше человеческих возможностей. Мы всегда стремились максимально использовать новые технологии, и теперь с их помощью пытались проникнуть в область, где еще никто до нас не бывал.

Решить эту сложнейшую вычислительную задачу исследователям Celera предстояло в корпусе № 2. В подвальных помещениях разместилось оборудование для осуществления этой грандиозной задачи: тонны свинцово-кислотных аккумуляторов, обеспечивающих бесперебойное электроснабжение компьютерного комплекса, расположенного этажом выше. Оборудовать компьютерную лабораторию стоило нам более 5 миллионов долларов – и это еще до поставки первых компьютеров. Столько стоила всего лишь установка кондиционеров, противопожарной системы и системы безопасности, – последнее было сделано по настоянию нашей страховой компании. Лаборатория не имела особо прочных стен, которые могли бы противостоять бомбовой атаке «луддитов» (не редкий случай в центрах обработки данных). Для входа в нее пришлось установить пропускную систему с охранниками и устройством сканирования отпечатков ладони PalmPrint.