ДНК. История генетической революции - читать онлайн книгу. Автор: Кевин Дэвис, Эндрю Берри, Джеймс Д. Уотсон cтр.№ 57

ПЦР быстро превратилась в главную рабочую лошадку проекта «Геном человека». В общем, процесс не отличается от разработанного Муллисом, просто он был автоматизирован. Мы больше не зависели от толпы подслеповатых аспирантов, кропотливо переливающих капельки жидкости в пластиковые пробирки. В современных лабораториях, осуществляющих молекулярно-генетические исследования, эта работа выполняется на роботизированных конвейерах. ПЦР-роботы, занятые в столь масштабном проекте по секвенированию, как «Геном человека», неумолимо трудятся с огромными объемами термостойкой полимеразы. Некоторые ученые, работающие в проекте «Геном человека», были возмущены неоправданно высокими отчислениями, которые добавляет к стоимости расходных материалов владелец патента на ПЦР, европейский индустриально-фармацевтический гигант Hoffmann-LaRoche.

Другим «движущим началом» стал сам метод секвенирования ДНК. Химическая основа этого метода в то время уже не была новинкой: Межгосударственный проект «Геном человека» (HGP) взял на вооружение тот же самый хитроумный метод, что еще в середине 1970-х годов разработал Фред Сенгер. Инновация же заключалась в масштабе и степени автоматизации, которых удалось достичь при секвенировании.

Автоматическое секвенирование исходно разрабатывалось в лаборатории Ли Худа в Калифорнийском технологическом институте. Он заканчивал школу в штате Монтана и играл в американский футбол на позиции нападающего; благодаря Худу команда не раз выигрывала чемпионат штата. Навыки командного взаимодействия пригодились ему и в научной карьере. В лаборатории Худа трудилась пестрая компания химиков, биологов и инженеров, и вскоре его лаборатория вышла в лидеры по части технологических инноваций.

Фактически метод автоматического секвенирования изобрели Ллойд Смит и Майк Хункапиллер. Майк Хункапиллер, который тогда работал в лаборатории Худа, обратился к Ллойду Смиту, предложив ему усовершенствованный метод секвенирования, в котором основания каждого типа окрашивались бы каждый в свой цвет. Такая идея могла в четыре раза повысить эффективность сенгеровского процесса. У Сенгера при секвенировании в каждой из четырех пробирок (по числу оснований) при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. Далее в пробирки добавляли формамид для расхождения цепей и проводили электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках. В варианте Смита и Хункапиллера дидезоксинуклеотиды метят четырьмя разными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке. Затем во время электрофореза в полиакриламидном геле луч лазера в определенном месте геля возбуждает активность красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Сначала Смит был настроен пессимистично – он опасался, что использование сверхмалых доз красителя приведет к тому, что нуклеотидные участки будут неразличимы. Однако, превосходно разбираясь в лазерных технологиях, он вскоре нашел выход из положения, используя специальные флюорохромные красители, которые флуоресцируют под действием лазерного излучения.

В классическом варианте метода Сэнгера одна из цепочек анализируемой ДНК выступает в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепочки ферментом ДНК-полимеразой, затем последовательность фрагментов ДНК сортируется в геле по размеру. Каждый фрагмент, который включается в состав ДНК во время синтеза и позволяет впоследствии визуализировать продукты реакции, помечается флуоресцентным красителем, соответствующим терминальному основанию (об этом говорилось на с. 124); следовательно, флюоресценция этого фрагмента будет идентификатором для данного основания. Затем остается лишь провести детекцию и визуализировать продукты реакции. Результаты анализируют с помощью компьютера и представляют в виде последовательности разноцветных пиков, соответствует одно из четырех нуклеотидам. Далее информация передается непосредственно в информационную систему компьютера, что исключает затратный по времени и порой мучительный процесс ввода данных, который весьма осложнял секвенирование.

Мелким шрифтом: последовательность ДНК, расшифрованная с использованием автоматического секвенатора, полученная из аппарата для автоматического секвенирования. Каждому цвету соответствующих четырем оснований.

Майк Хункапиллер покинул лабораторию Худа в 1983 году и поступил на работу в недавно образованную приборостроительную компанию Applied Biosystems Inc., известную под названием ABI. Именно ABI произвела первый коммерческий аппарат для секвенирования по методу Смита – Хункапиллера. По мере того как проект «Геном человека» набирал обороты, резко повысилась эффективность всего процесса секвенирования: от неудобных и вязких гелей было решено отказаться, реакционную смесь стали разделять методом капиллярного электрофореза в растворе, обладающем высокой пропускной способностью, фрагменты ДНК, выходящие из капиллярной колонки, регистрируются детектором флуоресценции. В сравнительном аспекте секвенаторы ABI отличались высокой скоростью; они работали примерно в тысячу раз быстрее сенгеровского прототипа. При минимальном участии человека (примерно пятнадцать минут работы на каждые 24 часа) эти машины успевали отсеквенировать примерно полмиллиона пар оснований в день. Автоматизация значительно ускорила процесс секвенирования и позволила осуществить секвенирование целых геномов, включая геном человека, что и позволило реализовать проект «Геном человека».

На первых этапах проекта «Геном человека» была оптимизирована технология секвенирования ДНК, следующей стала стадия картирования генома. Наша главная цель заключалась в приблизительной оценке всего генома, чтобы всем стало понятно, где именно локализуется каждый участок концевой последовательности ДНК. Геном предстояло разделить на удобоваримые фрагменты, которые затем предстояло картировать. Изначально мы решали эту задачу на материале искусственных хромосом дрожжей (YAC). Этот метод разработал Мэйнард Олсон, внедрявший большие фрагменты человеческой ДНК в клетки дрожжей. После имплантации YAC реплицировались вместе с обычными хромосомами дрожжей. Но при попытке загрузить миллион пар оснований из человеческой ДНК в одну хромосому дрожжей мы столкнулись с методологическими проблемами. Оказалось, что хромосомные сегменты перемешиваются, а поскольку суть картирования – это определение последовательности генов в хромосоме, подобное перемешивание – самое худшее, что могло бы произойти. Вот почему нам так пригодились искусственные бактериальные хромосомы (BAC), разработанные Питером де Йонгом в Буффало, представляющие векторные системы на основе F-плазмиды E. coli. Они мельче, длиной всего по 100 000–200 000 пар оснований, и гораздо менее подвержены перемешиванию. Короткий фрагмент ДНК исследуемого организма вставляется в хромосому, а затем амплифицируется и секвенируется. После этого прочитанные последовательности выравниваются in silico, в результате чего получается полная последовательность генома организма.

Команда, составившая костяк французского геномного проекта: Жан Вессанбаш – третий слева, а Дэниэл Коэн стоит справа. Рядом с Коэном – нобелевский лауреат Жан Доссе, иммунолог-провидец, инициировавший эти работы