ДНК. История генетической революции - читать онлайн книгу. Автор: Кевин Дэвис, Эндрю Берри, Джеймс Д. Уотсон cтр.№ 35

Страница

В США насчитывалось около восьми миллионов диабетиков, поэтому производство инсулина представлялось золотой жилой биотехнологии. Однако не только Бойер и Суонсон разглядели этот потенциал. Группа коллег Бойера из Калифорнийского университета в Сан-Франциско и Уолли Гилберт из Гарварда также осознали, что клонирование человеческого инсулина представляет как научный, так и коммерческий интерес. В мае 1978 года ставки возросли: Гилберт и еще несколько ученых из США и Европы основали собственную компанию Biogen. Столь разные корни у Genentech и Biogen показывают, как быстро развивалась вся отрасль: Genentech выдумал двадцатидевятилетний энтузиаст, готовый общаться с нужными людьми по телефону, а Biogen была создана уже целым консорциумом опытных венчурных капиталистов, нанявших на работу первоклассных ученых. Genentech родилась в одном из баров Сан-Франциско, Biogen – в фешенебельном европейском отеле. Началась гонка «биотехнологических вооружений».

Не так-то просто было заставить бактерию продуцировать человеческий белок. Лимитирующим фактором стало наличие интронов, некодирующих фрагментов ДНК, присутствующих в человеческих генах. Поскольку у бактерий интронов нет, то процесс сплайсинга не мог быть реализован. Суть этого явления состоит в то, что в человеческой клетке матричная РНК тщательно редактируется путем вырезания интронов из РНК так, чтобы они не мешали синтезу белков. У бактерий таких возможностей не было, что, безусловно, влияло на их способность синтезировать белок на основе человеческого гена. Таким образом, если уж мы действительно собирались научить E. coli производству человеческих белков из человеческих генов, то первым делом нужно было решить проблему с интронами.

Конкурирующие стартапы подступались к решению этой проблемы по-разному. В Genentech попробовали химически синтезировать нужные участки гена, но уже без интронов, а потом внедрять такой ген в плазмиду. Фактически в данном случае клонировалась искусственная копия исходного гена. В настоящее время такой метод используется редко, поскольку он неудобный, но во времена Genentech выбор такой стратегии казался весьма разумным. Еще свежи были воспоминания об Асиломарской конференции, посвященной биологическим угрозам и биобезопасности, поэтому генетическое клонирование, особенно с использованием человеческих генов, рассматривалось, но с серьезной оглядкой и жестко регламентировалось. Однако, используя искусственную копию гена, а не «натуральный» ген, взятый у человека, Genentech фактически нашла лазейку. Компания продолжала охоту за инсулином, и новые правила помехой не были.

Конкуренты Genentech действовали иначе, именно этот подход применяется сейчас. Однако использование ДНК из человеческих клеток привело к бюрократическим трудностям, иными словами, они вскоре увязли в бюрократическом болоте. В их методе было задействовано одно из самых удивительных открытий, которыми к тому моменту могла похвастаться молекулярная биология. Оказалось, что иногда может нарушаться ключевой догмат, регулирующий передачу генетической информации и синтеза новых белков. В 1950-е годы ученые открыли группу вирусов – это так называемые ретровирусы, у которых есть РНК, но отсутствует ДНК. Вирус иммунодефицита человека, вызывающий СПИД, как раз относится к этой группе. Дальнейшие исследования ретровирусов показали, что они способны преобразовывать свою РНК в ДНК после внедрения в клетку-хозяина. После инфицирования клетки-хозяина ретровирусом в цитоплазме начинается синтез вирусного ДНК-генома с использованием вирионной РНКв качестве матрицы. Такой «трюк» обеспечивает особый фермент – обратная транскриптаза, превращающая РНК в ДНК. Ретровирусы используют для репликации своего генома механизм обратной транскрипции: вирусный фермент обратная транскриптаза (или ревертаза) синтезирует одну нить ДНК на матрице вирусной РНК, а затем уже на матрице синтезированной нити ДНК достраивает вторую, комплементарную ей нить. За открытие этого фермента Говард Темин и Дэвид Балтимор в 1975 году были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине.

Клонирование кДНК для инсулина (ген без интронов) ознаменовало рождение био-чистый человеческий инсулин технологий

Обратная транскриптаза подсказала компании Biogen и другим компаниям красивый способ синтеза собственного человеческого инсулина для внедрения в бактерии – инсулина без интронов. Сначала выделяется матричная РНК, синтезируемая геном инсулина. Поскольку матричная РНК уже прошла «редактирование», в ней нет интронов, присутствовавших в ДНК, с которой она скопирована. Сама РНК не слишком полезна, поскольку в отличие от ДНК эта молекула хрупкая и способна стремительно распадаться; кроме того, система Коэна – Бойера нацелена на внедрение в бактериальные клетки именно ДНК, а не РНК. Таким образом, нужно было сделать ДНК из отредактированной матричной РНК, применив для этого фермент обратную транскриптазу. В результате получался фрагмент ДНК без интронов, но содержащий всю ту информацию, которая нужна бактерии для производства человеческого инсулина, – очищенный ген инсулина.

В итоге компания Genentech выиграла гонку, хотя с минимальным отрывом. Команда Гилберта, использовавшая метод с обратной транскриптазой, успешно клонировала крысиный ген инсулина, а затем «заставила» бактерию продуцировать крысиный белок. Оставалось только повторить такой же процесс с человеческим геном. Однако на этом этапе компания Biogen попала в бюрократическую мясорубку. Для клонирования человеческой ДНК команде Гилберта требовалось найти собственный карантинный корпус P4, помещение с максимальным уровнем защиты, таким же, какой требуется для работы со смертоносным вирусом Эболы. Ученым удалось уговорить британских военных допустить их в Портон-Даун – лабораторию, расположенную к северо-востоку от села Портон, рядом с городом Солсбери в графстве Уилтшир, которая являлась и является резиденцией Лаборатории оборонной науки и техники Министерства обороны Великобритании и Агентства общественного здравоохранения Англии.

Стивен Холл написал книгу о гонке за клонирование инсулина, в которой, в частности, описывает почти сюрреалистические унижения, которые приходилось сносить Гилберту и его коллегам.

Уже при входе в лабораторию P4 начинались настоящие мытарства. Ученые полностью раздевались, после чего натягивали казенные белые длинные трусы, черные резиновые ботинки, голубую униформу вроде пижамы, бежевый больничный халат, застегивающийся сзади, две пары перчаток и голубую пластиковую шапочку, напоминающую шапочку для душа. Затем всё быстро промывалось в формальдегиде. Всё. Все приборы, все бутылочки, вся лабораторная посуда, всё оборудование. Все научные рецепты, написанные на бумаге, также проходили такую мойку; так что ученые складывали бумагу по листику в пластиковые пакеты Ziploc и надеялись, что формальдегид туда не просочится и не превратит бумагу в бурую рассыпчатую массу вроде пергамента. Все документы, полежавшие в лаборатории на воздухе, после работы требовалось уничтожать, поэтому гарвардские специалисты даже не могли пронести в лабораторию блокноты для заметок. Миновав бассейн с формальдегидом, ученые спускались по короткой лестнице в саму лабораторию P4. Такая же гигиеническая канитель (в том числе душ) повторялась и перед выходом из лаборатории.

Страница