ДНК. История генетической революции - читать онлайн книгу. Автор: Кевин Дэвис, Эндрю Берри, Джеймс Д. Уотсон cтр.№ 28

Первые ответы на поставленные вопросы появились после того, как Арбер открыл новую группу ферментов, расщепляющих ДНК, – так называемые рестриктазы. Они присутствуют в бактериальных клетках и подавляют размножение вирусов, разрезая на фрагменты чужеродную ДНК. Такое разрезание ДНК – это специфическая реакция на конкретные последовательности: фермент разрезает нить ДНК, лишь если обнаружит в ней искомую последовательность. EcoRI была одной из первых открытых рестриктаз – она находит и обрезает нить оснований ГААТТЦ ^[3].

Однако почему бактерия при этом не обрезает собственную ДНК везде, где в ней встречается последовательность ГААТТЦ? Здесь Арбер совершил второе великое открытие. Бактерия синтезирует не только рестриктазу, нацеленную на конкретные последовательности, но и второй фермент, химически модифицирующий те самые последовательности в собственной ДНК, как только они ему попадаются ^[4]. Измененные таким образом последовательности ГААТТЦ, присутствующие в бактериальной ДНК, не привлекают рестриктазу EcoRI, даже когда фермент словно катком проносится по клетке, повсюду разрезая замеченные вирусные ДНК. Защита бактериального генома от собственной рестриктазы осуществляется с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина и называется маскированием.

В основе следующего этапа революции в молекулярной биологии, связанной с рекомбинантной ДНК, было изучение развития у бактерий антибиотикорезистентности. В 1960-х годах выяснилось, что у многих бактерий такая резистентность возникает не по стандартной схеме через мутацию бактериального генома, а путем импорта так называемой плазмиды: это небольшие молекулы ДНК, находящиеся внутри бактерии, физически отдельные от геномных хромосом и способные реплицироваться автономно и передаваться потомству вместе с остальным бактериальным геномом при делении клеток. В некоторых случаях бактерии сами могут обмениваться плазмидами, и в таком случае бактерия-получатель приобретает «информационный набор», которого у нее не было «при рождении». Таким образом, плазмиды служат средством горизонтального переноса генов. В передаваемом информационном комплекте часто имеются гены, как раз и обеспечивающие резистентность к антибиотикам. Естественный отбор у бактерий, работающий в направлении антибиотикорезистентности, благоприятствует тем клеткам, у которых имеется плазмидный фактор антибиотикоустойчивости.

Плазмида под электронным микроскопом

Первопроходцем в исследовании плазмид был Стенли Коэн из Стэнфордского университета. Коэн выбрал медицинскую карьеру, поскольку его вдохновил на этот путь школьный учитель биологии. Закончив медицинский университет, он подумывал заняться внутренними болезнями, но забросил эти планы, когда перед ним встал выбор – пойти служить армейским врачом или занять должность в Национальных институтах здравоохранения. Вскоре он осознал, что исследовательская деятельность ему более интересна, чем практическая медицина. Первый серьезный успех ждал его в 1971 году, когда Коэн научился управлять захватом бактериями E. coli плазмид вне пределов клетки. Фактически Стенли Коэн «трансформировал» E. coli подобно тому, как Фред Гриффит сорока годами ранее превратил жизнеспособные пневмококки в нежизнеспособные, «заставив» их поглотить участок ДНК. В опытах Коэна бактерия поглощала плазмиду с генами устойчивости к антибиотикам, и штамм, ранее погибавший от антибиотика, терял восприимчивость к нему. Штамм сохранял устойчивость к антибиотику и в последующих поколениях – копии плазмидной ДНК в целости и сохранности передавались потомкам при делении клеток.

К началу 1970-х годов имелись все составляющие для получения рекомбинантной ДНК. Сначала было нужно разрезать молекулу ДНК при помощи рестриктаз и выделить интересующие нас последовательности (гены), а затем скопировать интересующий нас фрагмент ДНК и вставить плазмиду в бактериальную клетку, как USB-флешку в подготовленный для нее разъем. За этим процессом последует обычное бинарное деление бактерий, и плазмида с выбранным нами фрагментом ДНК будет реплицироваться точно так же, как и собственный генетический материал, унаследованный бактериальной клеткой. Таким образом, после пересадки единственной плазмиды в бактериальную клетку в процессе последующего деления бактерии в огромных количествах будет воспроизводиться выбранная нами последовательность ДНК. Поскольку мы сами способствуем воспроизводству выбранной клетки, то через короткий промежуток времени мы создадим колонию из миллиардов бактериальных особей, а значит, и миллиарды копий интересующего нас фрагмента ДНК. Соответственно, полученная нам колония – это завод по производству ДНК.

Все три операции – вырезание, вставка и копирование – были выполнены в 1972 году в Гонолулу. Это произошло на конференции, посвященной исследованию плазмид. На этой конференции присутствовали Герб Бойер, молодой ученый, недавно получивший пост штатного профессора в Калифорнийском университете в Сан-Франциско, и, что ожидаемо, Стенли Коэн, один из первых исследователей плазмид. Оба они были выходцами с востока США. Бойер происходил из Западной Пенсильвании и в старших классах играл в футбол – был нападающим. Пожалуй, ему очень повезло, что тренер по футболу одновременно был учителем естествознания. Как и Коэн, Бойер являлся представителем нового поколения ученых, воспитанных на идее двойной спирали. Он так увлекался изучением ДНК, что даже назвал своих сиамских котов Уотсон и Крик. Поэтому никто, включая тренера, не удивился, когда по окончании колледжа Бойер решил заняться генетикой бактерий.

Хотя и Коэн, и Бойер в те времена работали на берегах бухты Сан-Франциско, до гавайской конференции они не встречались. Бойер был экспертом по рестриктазам уже тогда, когда о них практически никто еще не слышал; именно он и его коллеги определили последовательность оснований на участке, вырезаемом рестриктазой EcoRI. Вскоре Бойер и Коэн осознали, что в альянсе друг с другом смогут вывести молекулярную биологию на совершенно новый уровень – в мир копирования, вырезанияи вставок. Как-то поздним вечером они зашли в ресторанчик в районе Вайкики и принялись фантазировать о зарождении технологии рекомбинантной ДНК, кратко конспектируя свои идеи прямо на салфетках. Такую форму предвидения будущего окрестили «от солонины к клонированию».

Через несколько месяцев наладилось сотрудничество между лабораториями Бойера (в Сан-Франциско) и Коэна (в 64 километрах к югу от Пало-Альто). Герб Бойер продолжал работать над исследованием рестриктаз, а Стенли Коэн ставил опыты с плазмидами. На их удачу, у Коэна была лаборантка Энни Чанг, которая жила в Сан-Франциско и успешно осуществляла обмен драгоценной информацией о результатах исследований, проходящих в этих лабораториях. На первом этапе ученые решили создать гибрид – рекомбинант, состоящий из двух разных плазмид, каждая из которых была устойчива к конкретному антибиотику. В одной плазмиде имелся ген (участок ДНК), обеспечивавший устойчивость к тетрациклину, а в другой – ген устойчивости к канамицину. (Как вы уже догадываетесь, исходно бактерии с первой плазмидой погибали от канамицина, а бактерии с второй плазмидой – от тетрациклина.) Предполагалось сконструировать единую «суперплазмиду», которая бы обеспечивала устойчивость к обоим антибиотикам.